31 mars 2013

Kjære lichenologer tilknyttet DNA-lab (BDL)!

Etter å ha jobbet med å optimisere PCR-reaksjoner for lav en god stund, har jeg i «Xanthoria calcicola-prosjektet» kommit frem til en robust protokoll. Og hemmeligheten, fant jeg til slutt ut, var å skifte taq!

Historien er sirka sånn:

Når jeg startet med Xanthoria parietina i 2002, brukte vi Herculase taq i 50 yl-reaksjoner (Lindblom & Ekman 2005, Mycol.Res.). Allerede fra PCR no 1 hadde jeg høy suksess-rate – det virker som Xanthoria generellt er takknemlig å jobbe med molekylært. Jeg ser i labjournalen at jeg av og til kjørte noen PCR med AmpliTaq og/eller AmpliTaq Gold, med varierende resultat. Herculase var altid best.

En gang i 2003 gikk vi over til AmpliTaq, Maria optimiserte litt på den nye PCR-maskinen, og kjørte partial IGS (ca 300 bp) med stort hell. Inimellom brukte hun Herculase ser jeg, antagelig på litt vanskelige prøver.

En gang i 2004 gikk laben over til KlenTaq, fordi den var billig. I begynnelsen virket den fint, men som noen av dere vet så måtte vi slutte pga at den begynte å lage smear, og vi klarte aldri å finne ut hva som var galt. (Hvis jeg husker riktig.) Til tross for at Heidi hadde kontakt flere ganger med produsenten…

Så vi gikk tilbake til AmpliTaq, og straks etter det, i 2005, var populasjonsprosjektet mitt ferdig på lab.

Når jeg kom tilbake på lab med lavmateriale i 2008 var det Pannariaceae og Amplitaq. I 2009 testet jeg AmpliTaq, Qiagen taq og Takara taq på Degelia IGS og AmpliTaq var fortsatt «best».

Nåvel, tilbake til Xanthoria; nå Xanthoria calcicola. Helt fra begynnelsen hadde jeg problemer med PCR som ikke virket, eller - når de virket - doble bånd, dårlige sekvenser, you name it. Jeg har optimisert siden desember 2009: Forskjellig reaksjonsvolum, AmpliTaq vs. AmpliTaq Gold vs. VWRtaq, forskjellig mengde DNA, ulike PCR-programmer, temperatur-gradienter… Noen ganger da jeg trodde at protokollen endelig var OK, ble neste kjøring bare skit…

Til slutt, i august 2012, kjøpte jeg en tube Herculase (BioNordika) for 4664,25 kroner! Etter det gikk alt så mye bedre; nesten 100% suksess-rate på PCR, bedre primerspesifisitet og ekstremt ryddige og lett editerte  sekvenser! Jeg sekvenserer nå total  ITS (ca 520 bp) med bare en primer (ITS1f).

Jeg bruker 0,15 μl Herculase taq i 25 µl-reaksjoner. Da koster det 10 kroner per reaksjon. Fordi jeg fikk veldig mye DNA (ITS) med den originale PCR-cyclingen, har jeg laget ett kortere program på BioRad-maskinene våre. Legger ved ett eksempel på en vellykket PCR.

Jeg har skrevet hele denne historien, fordi jeg mener Herculase bør prøves  på «vanskelige» lav-ekstrakter! Jeg har brukt opp tuben fra i høst, men vil kjøpe mere, og DNA-lab tilbyr fra nå av Herculase taq som et alternativ til AmpliTaq/AmpliTaq Gold.

Hilsen,

Louise

(Ansvarlig tekniker DNA-lab)